禽流感檢測方法研究進(jìn)展
1 病毒的分離鑒定
無菌采集病料經(jīng)處理后接種9～11日齡雞胚，收取尿囊液測定血凝活性，若為陰性則應(yīng)繼續(xù)盲傳2－3代。對具有血凝活性的尿囊液需先用新城疫（ND）抗血清做血凝抑制（HI）試驗(yàn)，以排除ND感染。然后用免疫擴(kuò)散等方法來檢測特異性核心抗原——核糖蛋白（NP）或基質(zhì)蛋白（MP），再用血凝抑制試驗(yàn)和神經(jīng)氨酸酶抑制試驗(yàn)鑒定A型流感病毒亞型。分離鑒定的同時，進(jìn)行致病力試驗(yàn)，確定毒力強(qiáng)弱。
病毒的分離鑒定對禽流感的診斷比較確實(shí)，但操作程序繁瑣，費(fèi)用多，耗時費(fèi)力。
2 血清學(xué)診斷技術(shù)
2．1 瓊脂擴(kuò)散（AGP）試驗(yàn)進(jìn)行病毒抗原型特異性鑒定
即用已知陽性血清和未知抗原進(jìn)行AGP試驗(yàn)。受檢樣品是具有血凝素活性的雞胚尿囊液。AGP是用來檢測A型流感病毒群特異性血清抗體，即抗核糖蛋白（KNP）基質(zhì)蛋白（MP）抗體，因而適用于鑒定流感病毒。1979年Beard首次將AGP用于食流感抗體的檢測。
此法雖然簡單易行，但是敏感性較差，易出現(xiàn)假陽性。AGP最常用的是免疫雙擴(kuò)散，陳海燕分別開展了禽流感病毒快速定型雙擴(kuò)散法的研究，不僅提高了其敏感度，且快速省時，在此方法基礎(chǔ)上建立的AGP診斷技術(shù)及其診斷試劑盒，在全國范圍內(nèi)得到推廣應(yīng)用，并取得良好的效果。
2.2 血凝(HA)血凝抑制試驗(yàn)（HI）
一般情況下，新分離毒株要先鑒定出特異性NP或MP抗原型（用AGP）確定禽流感病毒，再做HA亞型的鑒定。
現(xiàn)已有人采用改進(jìn)HA試驗(yàn)方法，稱為HA加敏法。該法測抗體效價(jià)比常規(guī)法高2－4倍，若抗原用乙醚裂解，其敏感性比常規(guī)法高4～6倍，但觀察時以30分鐘內(nèi)為好，否則易出現(xiàn)假陽性。另外，還應(yīng)注意在HI試驗(yàn)時，應(yīng)先除去非特異性凝集反應(yīng)。許多禽類血清都含有非特異性因子，能和紅細(xì)胞表面受體競爭性地作用于病毒表面的血凝素而發(fā)生非特異性凝集反應(yīng)。通常用廣州健侖生物科技有限公司供應(yīng)的受體破壞酶（RDE）即霍亂菌培養(yǎng)液處理法或高碘酸鈉法制備血清。
HA、HI特異性好，是亞型鑒定的常用方法，但其操作過程繁瑣費(fèi)時，并且由于用已知HA亞型的抗血清不能檢出新的HA亞型的禽流感病毒，所以用該方法鑒定不如瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)簡便和快捷。
2．3 神經(jīng)氨酸酶抑制試驗(yàn)（NIT）
根據(jù)A型流感病毒的表面抗原特性，特別是血凝素（HA）和神經(jīng)氨酸酶（NA）特性，不僅可通過HI試驗(yàn)對病毒進(jìn)行鑒定，而且可通過NI試驗(yàn)進(jìn)行鑒定。1983年R.A.Van．Deusen介紹了NI試驗(yàn)的一種改進(jìn)法——平板微量NI試驗(yàn)，此法雖不能提供常量法的定量，但卻是A型流感病毒的病毒分類和抗體檢測的快捷方法。試驗(yàn)證明，微量NI試驗(yàn)?zāi)軐Ψ蛛x物做出準(zhǔn)確鑒定，而常量NI試驗(yàn)檢測亞型混合物更敏感。
目前國立獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)所已將微量NI試驗(yàn)列為流感病毒分離物定型及篩選畜禽血清9型NA抗體的常規(guī)方法。診斷中也已廣泛采用此法，特別是美國在80年代火雞發(fā)生流感病毒期間，各次流行所得的血清樣本用微量NI試驗(yàn)所作出的A型流感病毒亞型鑒定結(jié)果已被病毒分離、疫苗接種和流行病學(xué)資料所證實(shí)。這種方法已被證明是快速的，且成本較低和有可重復(fù)性。這種技術(shù)的可靠性將導(dǎo)致NI試驗(yàn)的廣泛應(yīng)用。
2．4 中和試驗(yàn)（NT）
以中和試驗(yàn)（NT）來鑒定或滿定流感病毒時，常用雞胚或組織培養(yǎng)細(xì)胞，操作方法與其他病毒（如NDV）的中和試驗(yàn)相同。
NT試驗(yàn)是最敏感而特異的血清學(xué)方法，只有抗體與病毒顆粒上的表面抗原相對應(yīng)，特別是與吸附到宿主細(xì)胞上的病毒表面抗原相對應(yīng)，才能在實(shí)驗(yàn)中取得滿意的顯示效果。因此，某一個血清型的中和實(shí)驗(yàn)機(jī)體只與同組內(nèi)的其他病原表現(xiàn)出有限的交叉反應(yīng)。
病毒中和實(shí)驗(yàn)操作繁瑣耗時費(fèi)料，臨床上幾乎不用。但作為經(jīng)典方法在病毒鑒定中起著重要作用，許多新的檢測方法都要以此作為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較。
2.5 免疫熒光技術(shù)（IFT）
免疫熒光技術(shù)就是熒光抗體技術(shù)（FAT）。IFT早在1961年就開始用于人類流感的快速診斷。1984年美國賓西法尼亞州爆發(fā)禽流感時Skeeles將IFT首次用于AIV的檢測。IFT最早用于病毒的鑒定和定位病毒感染細(xì)胞中特異性抗原，主要是核內(nèi)熒光；用MP抗原的熒光抗體主要出現(xiàn)胞質(zhì)熒光，核內(nèi)也有部分熒光。
用于禽流感病毒的診斷常用直接熒光抗體法，即在組織觸片上直接染色，以熒光顯微鏡檢查熒光，一種AIV的熒光抗體可用來檢測不同亞型的其他病毒。
IFT用于診斷具有快速、簡便、敏感性好的特點(diǎn)，而且費(fèi)用較低。其敏感度同病毒的分離鑒定相當(dāng)，有時高于用雞胚進(jìn)行的病毒分離。但是需要注意的是如何避免和降低標(biāo)本中出現(xiàn)的假陽性問特異性熒光）問題。
對一株雜交瘤細(xì)胞分泌的流感病毒的單克隆抗體進(jìn)行檢測時，發(fā)現(xiàn)間接固相免疫熒光技術(shù)的敏感性比HI高 40－150倍。間接免疫熒光技術(shù)也可以用來檢測核蛋白（NP）基質(zhì)蛋白（MP）抗原與抗體的反應(yīng)，其敏感性很高。但對抗原制備要求較高，需用非離子型去污劑對純化的病毒粒子進(jìn)行裂解。
2．6 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）
1974年Jenning等首先用ELISA對注射流感病毒所產(chǎn)生的抗體消長規(guī)律進(jìn)行了檢測，Lanbre認(rèn)為ELISA的敏感性遠(yuǎn)高于HI補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)。Meulemans（1987）對ELISA．AGP，HI檢測AIV抗體 進(jìn)行了比較研究，發(fā)現(xiàn) AGP和 ELISA一樣均能檢測型特異性抗原（抗體），但敏感性遠(yuǎn)低于ELISA，HI適用于亞型的檢測，其敏感性不如ELISA。1993年，Shodihall用混合纖維素脂膜或硝酸纖維素膜代替微量反應(yīng)板，建立了快速診斷的DAS～ELISA，大大縮短了診斷時間，并可保留ELISA的特異性、敏感性，其結(jié)果又不需要特殊儀器分析，可用肉眼判定。
隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所的李海燕等用表達(dá)禽流感病毒核蛋白的桿狀病毒感染S。昆蟲細(xì)胞，以其表達(dá)產(chǎn)物制備抗原，建立了以桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)的AIV核蛋白為抗原的禽流感間接（重組核蛋白）ELISA診斷技術(shù)（rNP－ELISA，確定了其最適工作條件，并對3 138份雞血清進(jìn)行了檢測，實(shí)驗(yàn)證明，rNP－ELISA與全病毒間接ELISA（AIV－ELISA），AGP及HI的符合率分別為99.9％，97.1％，98.8％;并能100％檢出AGP陽性及疑似HI陽性的血清樣品，這證明了rNP－ELISA是檢測A型禽流感病毒血清特異性抗體的一種特異、敏感、微量?？旖?、經(jīng)濟(jì)的血清學(xué)診斷技術(shù)。
ELISA方法的敏感性和特異性與抗原的純度直接相關(guān)。1984年Abraham等報(bào)道了抗原快速提純法，所需時間比常規(guī)法縮短10倍，并且研究結(jié)果表明應(yīng)用提純抗原幾乎全部排除了假陽性反應(yīng)。
目前美國Kiregard Reery和Labortories有試劑盒出售。ELISA成為AI流行病學(xué)普查及早期快速診斷的最有效和最實(shí)用的方法。
3 分子生物學(xué)技術(shù)
3.1 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）及反轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈反應(yīng)（RT——PCR）
PCR是近來發(fā)展成熟起來的一種體外基因擴(kuò)增技術(shù)，能在數(shù)小時內(nèi)使DNA呈指數(shù)增加，已成功地用于多種病毒的基因檢測和分子流行病學(xué)調(diào)查等。其檢測原理為：尋找傳染性因子的特異DNA序列，對待測樣品進(jìn)行PCK擴(kuò)增。如果檢測出了相應(yīng)的擴(kuò)增帶，則判為陽性反應(yīng)；反之，無擴(kuò)增帶則為陰性反應(yīng)。
鑒于引起致病的禽流感病毒多是H5和H7血清亞型，在PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上，崔尚金等（1998）建立了一種直接檢測禽糞樣和雞胚尿囊液中AIV已亞型RNA的RT－PCR反應(yīng)，并將此法與AGP和電鏡技術(shù)作了比較，結(jié)果表明引物的特異性決定了產(chǎn)物的特異性，并且該方法靈敏度高，檢測過程僅需到。時左右，并且大大縮短了感染后的檢出時間。
應(yīng)用毛細(xì)管PCR（15分鐘30個循環(huán)）代替常規(guī)PCR（2．5個小時30個循環(huán)）以進(jìn)一步縮短檢測時間的研究也已展開并進(jìn)入更深入的領(lǐng)域，以期用于不同樣品（組織、組織液、分泌液、糞便等）的檢測，區(qū)分高致病力毒株和低致病力毒株與非致病力毒株，從而深入探討該方法在AIV的臨床早期診斷，流行病學(xué)調(diào)查及發(fā)病機(jī)制中的應(yīng)用價(jià)值，為我國AIV的綜合防治措施做出貢獻(xiàn)。
3．2 核酸探針技術(shù)
核酸分子雜交技術(shù)是目前生物化學(xué)和分子生物學(xué)研究應(yīng)用最廣泛的技術(shù)之一，是定性和定量檢測特異性DNA或RNA的有力工具。
核酸探針技術(shù)的原理：在進(jìn)行雜交時，用一種預(yù)先分離純化的已知DNA或RNA序列片段去檢測未知的核酸樣品，對作檢測用的已知DNA或RNA序列片段加以標(biāo)記的片段就稱為核酸探針。作為核酸探針的DNA或RNA是各種病原微生物基因的一部分。在變性分開的待檢DNA或RNA單鏈中加入與其有互補(bǔ)作用的核酸探針。探針在一定條件下就能與原來變性分開的DNA或RNA單鏈上的互補(bǔ)區(qū)段形成氫鍵，從而結(jié)合成雜交雙鏈，通過洗滌，除去末雜交上的標(biāo)記物，然后進(jìn)行放射自顯影，即可確定原待檢樣品有無與探針互補(bǔ)的DNA或ILNA序列。
Bashiruddin等（1991）報(bào)道了擴(kuò)增HA基因來分析致病毒株與非致病毒株的差異，證實(shí)了致病毒株與非致病毒株氨基酸的差異，顯示了本方法的應(yīng)用前景。
3．3 熒光PCR法
利用生物學(xué)手段，用熒光PCR方法快速檢測禽流感病毒的方法已在北京通過專家鑒定，這一研究成果不僅在國內(nèi)屬于首次，而且在國際上也屬于先進(jìn)水平。它與國際標(biāo)準(zhǔn)方法雞胚病毒分離相比，不僅無需做雞胚病毒分離培養(yǎng)，而且時間也由原來最短的21天縮短為4小時。
4 電鏡技術(shù)
由于流感病毒為正粘病毒，屬于形態(tài)特征性強(qiáng)的病毒，因而可用電鏡技術(shù)來診斷，為提高禽流感的檢出率，除樣品制備技術(shù)外，取病料的部位和時間也是獲得準(zhǔn)確檢驗(yàn)結(jié)果的關(guān)鍵。病料的采集部位及取材時間應(yīng)根據(jù)禽流感病毒在動物體內(nèi)的分布特征及其感染特性而定。
5 展 望
在以上各種檢測方法及科學(xué)技術(shù)發(fā)展的基礎(chǔ)上，將PCR技術(shù)與ELISA技術(shù)結(jié)合起來，建立一種新的實(shí)驗(yàn)室檢測AIV的方法，將有較大的研究價(jià)值。其實(shí)驗(yàn)原理（以此類方法中最簡單的雙引物雙標(biāo)記法為例）如下：
PCR的一對引物中，其中一種引物用生物素標(biāo)記，另一種引物用地高辛標(biāo)記，酶標(biāo)微孔板上用生物素的親和素包被（生物素的親和素與生物素特異的結(jié)合）。PCR擴(kuò)增后經(jīng)純化去除引物、dNTP、引物二聚體等小分子后，將PCR擴(kuò)增后純化片段加入微孔板中。此時，微孔板上包被的生物素親和素將與引物上的生物素結(jié)合而捕捉了PCR片段，再在微孔板中加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗地高辛抗體，該抗體將與另一引物上的地高辛結(jié)合，從而形成生物素親和素一生物素一PCR片段一地高辛一抗地高辛一酶的復(fù)合物。加入酶的相應(yīng)底物進(jìn)行顯色，便可判斷PCR擴(kuò)增的有無。由于該方法是PCR技術(shù)和ELISA技術(shù)的結(jié)合，所以它是一種兩級放大系統(tǒng)，即PCR放大和ELISA放大，故而它的靈敏度更高。同時這種方法避免了PCR產(chǎn)物分析時的電極及染色過程，所以更為快捷、簡便、靈敏。
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